诺贝尔奖获得者：雅克·杜波谢
雅克·杜波谢出生在瑞士的艾格。他在洛桑大学学习物理，后来在日内瓦大学学习分子生物学。1973年，他在日内瓦大学和巴塞尔大学完成了生物物理学博士论文。从1978年到1987年，他在海德堡的欧洲分子生物学实验室工作，后来回到洛桑大学工作。
20世纪80年代初，雅克·杜波谢成功地快速冷却了水得到玻璃态的固体，而不是通常情况下的晶体态的冰。使得生物样品能够成功应用于电子显微镜的观察。
诺贝尔奖获得者：阿希姆·弗兰克
阿希姆·弗兰克出生于德国北莱茵-威斯特法伦州的锡根。在弗莱堡大学和慕尼黑大学学习后，他于1970年在慕尼黑工业大学获得博士学位。Frank曾在美国和欧洲的几所机构工作，包括Wadsworth中心、纽约州卫生部、奥尔巴尼的纽约州立大学、霍华德休斯医学研究所和哥伦比亚大学，自2008年以来一直在哥伦比亚大学工作。阿希姆·弗兰克已婚，育有两个孩子。
在1975年到1986年之间，Joachim Frank开发了一种通过算法分析和合并模糊的二维电子显微镜图像得到清晰的三维图像的方法。使得电子显微镜可以观察更多的生物分子。
诺贝尔奖获得者：理查德·亨德森
理查德·亨德森出生于苏格兰爱丁堡。在爱丁堡大学学习后，他于1969年在剑桥大学MRC分子生物学实验室获得博士学位。在美国的耶鲁大学呆了一段时间后，他于1973年回到MRC分子生物学实验室，之后一直在这里工作。
理查德·亨德森利用二维晶体的方法成功将细菌视紫红质等生物分子的分辨率推进到了原子分辨率。
研究工作介绍
<一> 从光学显微镜到电子显微镜
人们对于世间万物都充满着着好奇，常言道眼见为实，图像信息是我们理解一切事物的关键所在。但在古代，人们对事物的观察只能通过肉眼来实现，而人眼的分辨能力只有约为0.1毫米，因此对许多事物的认知并不全面。大约在一千多年前，人们偶然发现把透明水晶或宝石磨成“透镜”，发现这些透镜可以放大影像，第一次使得人眼的观察能力得到了提升。
虎克所用的显微镜及其绘制的木栓细胞图
到了1590年，荷兰人詹森发明了世界上第一台显微镜。1665年，英国科学家虎克（R. Hooke）用显微镜观察植物的木栓组织，发现是由许多规则的小方格组成的，他把观察到的图像画了下来，并把这些小方格称为cell，也就是英文的细胞。后来荷兰人列文虎克（A. van Leeuwenhock）自己学会了磨制透镜，制造了一台显微镜，并观察到了微小植物和动物的结构，对生物学的发展做出了巨大的贡献。从此，生物学得到了显著的发展，借助显微镜，人们能观察到更细小的结构。
光学显微镜
但是这种显微镜，首先用光照射到被观察的物体上,再通过对反射光的处理,最终得到的放大的图像，因此我们一般称为光学显微镜。但是光学显微镜的放大能力是有局限性的，现在的光学显微镜最高也只是能把物体放大2000倍。显微镜的分辨能力大约是可见光波长的一半，而可见光的波长范围为300~700纳米，因此光学显微镜的理论最小分辨力为0.172微米，面对再细小的结构就无能为力了。
显微镜的放大原理
随着科技的发展，光学显微镜已经不能满足科研需求了。20世纪之后，量子力学得到了显著的进步，人们对微观粒子的认识更近了一步。电子具有波粒二象性的特征，具有干涉和衍射等波动现象。通过对电子进行加速，加速电压为50~100kV时，此时电子的波长0.0053~0.0037纳米，这远远小于可见光的波长。如果能使用电子作为显微镜的介质，那么分辨率能得到很大的提升，人们就能观察到更精细的结构。
1931年，德国人克诺尔和鲁斯卡使用冷阴极放电电子源和三个电子透镜改装了一台高压示波器，获得了放大几十倍的图像，证明了电子显微镜放大成像的可能性。经过鲁斯卡的改造后，电子显微镜的分辨率提高到了50纳米，约为当时光学显微镜分辨能力的十倍，电子显微镜开始受到人们的重视。电子显微镜使得人们能看清病毒和一些大分子，后面发明的扫描隧道显微镜使得人们能看清原子的结构。
电子显微镜的组成结构包括镜筒，真空系统和电源柜三个部分。其中镜筒包括电子源、电子透镜、样品架、荧光屏和探测器等部件。其中电子透镜是最重要的部件。光学显微镜中的凸透镜使得光束聚集，电子透镜则使得电子束聚集。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，通过强磁场使得电子聚集。
光学显微镜和电子显微镜原理对比图
投射电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，只不过它使用电子束为光源，而电磁场为透镜。由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50纳米左右的超薄切片。透射电镜，是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像，影像在放大、聚焦后在成像器件（如荧光屏、胶片、以及感光耦合组件）上显示出来。
现代电子显微镜
<二>生物材料的观察
电子显微镜需要用高速的电子轰击物质的表面，因此通常适用于“无生命”的样品。对于生物材料来说，它比较脆弱，经不起电子的狂轰滥炸，因此新发明的电子显微镜不能用于生物学的研究。
1934年马顿（Ladislaus Laszlo Marton）使用了电子显微镜检测生物标本，并撰文提出了两种可能的解决方案：使用负染色法或者使用低温冷却生物材料。
负染色法在20世纪40年代出现之后逐渐地得到了完善，它是将重金属盐离子形成了一层非晶体膜，然后将生物分子镶嵌在膜里面。重金属盐离子和生物分子对电子的散射能力不同，反映在图片上就是白色的生物分子样品散布在黑色的背景中。但是这种方法的分辨率受到重金属盐的颗粒大小所限。虽然如此，但在当时那个年代，使用负染色法可以看到普通光学显微镜下无法看清的结构，因此在一些生物分子的三维结构以及三维重构技术方面仍然发挥了重要的作用。现在负染色法仍然广泛应用于样品前期筛选和初始模型构建等方面。
但是负染色法只能观察到细胞器大小的结构，对于更小的单分子或分子复合物来说就无能为力了。
马顿的第二个设想是让生物样品处在低温下，这样的话，生物样品能扛得住更多的电子轰击，同时生物样品在真空中脱水变形的问题也得到了解决。但是水在低温下形成晶体冰，晶体冰使得电子发生强烈的衍射，导致探测器收集到的几乎都是晶体冰的信号，这样就把生物分子的信号给遮掩过去了。同时，晶体冰也会影响蛋白的天然结构。而大部分的生物分子只有在水溶液中才能维持它的天然空间结构。因此要让生物样品在低温下仍然保持天然构想，必须解决晶体冰的问题。
理论上，可以通过将液态水快速冷却成玻璃态(非晶体态)从而克服结晶冰形成的问题。但20世纪80年代以前的理论预测表明，大量的水相变形成玻璃态冰所需要的冷却速度是很难达到的。1980年迈尔的研究证实了快速冷冻尺寸在微米级别的微滴可以将其转化成玻璃态冰。
20世纪80年代，雅克·杜波谢设计出了将薄水膜冷冻成玻璃态薄冰膜的可行性方案。将含有样品的溶液滴在处理过的铜网中，通过处理形成一层纳米到微米级别的薄水膜，然后迅速浸没到-180℃温度下（液态乙烷或丙烷），此时铜网上的薄水膜就迅速被冻成薄冰膜，同时生物样品也固定在薄冰膜中了。杜波谢利用此法制备了多种不同种类的生物分子的冷冻样品，如噬菌体，DNA，病毒，核糖体等冷冻样品。表明这种方法可行性好，重复性高。
雅克·杜波谢冷冻生物样品的制备方法
<三> 提高生物样品的分辨率
杜波谢发明的制样方法使得电镜生物学进入了冷冻电镜时代，为解析高分辨结构奠定了基础。1990年，理查德·亨德森等人在冷冻制样方法的基础上，利用二维晶体的方法成功将细菌视紫红质的分辨率推进到了原子分辨率。
最早亨德森是利用X射线技术来解析生物分子结构的，但这种方法需要得到生物分子晶体状态，而膜蛋白等生物分子的结晶异常困难。在经历多次失败后，亨德森转而使用电子显微镜技术来研究，因为电镜不需要生物分子结晶就能解析其结构。
最早观察到的视紫红质
细菌视紫红质是一种特殊的蛋白质，它在一定条件下会形成一层整齐的紫膜，而紫膜就是一种二维晶体，因为该蛋白质只在一个平面上整齐排列，不会向立体第三个方向堆叠。亨德森等人另辟蹊径，直接将紫膜制成了样品。那是还没有冷冻样品的概念，亨德森制作的是常温样品，为了防止样品在真空环境下变干，他在其中加入了0.5%葡萄糖溶液。
通常的生物样品在测试的时候只能使用较低的电子剂量，因而成像质量较低。而二维晶体会使电子发生衍射，通过软件处理可以提高成像质量。通过旋转样品，可以得到样品在不同角度下的数据，可以使用晶体解析的方法来构建视紫红质的三维结构，而化学上的晶体解析的技术已经十分成熟了。
通过以上方法，亨德森将这个蛋白膜结构的分辨率解析到了0.7nm，第一次看到了膜蛋白的跨膜螺旋结构。后来冷冻电镜技术得到发展以后，亨德森也进行了大量的研究，并在1990年将视紫红质的分辨率进一步提高到了0.35nm。
1990年观察到的视紫红质
亨德森的工作不仅是第一个将膜蛋白解析到了原子水平分辨率，也给冷冻电镜解析原子水平分辨率结构增强了信心。随后，捕光复合物，αβ二聚微管蛋白、水通道蛋白等膜蛋白的高分辨结构也被解析出来了。
<四>实现对更多生物分子的观察
但是，不是所有的生物分子都能形成二维晶体的，更多的生物分子只能以单个分子的形式在溶液中存在。单个分子三维结构的电镜解析只能通过单颗粒冷冻电镜三维重构的方法来进行。
20世纪70年代，阿希姆·弗兰克(Joachim Frank)等人最初研究的是低电子剂量下增强图片的成像质量。通过对齐后叠加的方法能提高图片的成像质量（增强信噪比），弗兰克得到了谷氨酰胺合成酶的二维投影平均图。但生物分子在不同角度的二维投影是不同的，即使是同一个方向的投影，不同构象时产生的二维投影也是不同的。需要对生物分子不同角度的投影进行分别归类。通过寻找投影特征点或特征区域，通过比较特征点或特征区域就可以进行分类。但在低质量的图片中寻找体征点或特征区域也是一个挑战。弗兰克和van Heel使用了一种叫做多维数据分析方法得到了解决。
同种生物分子分别在2011年（上）和2016年（下）的电镜图
从二维投影重构三维结构，需要确定每个二维投影在三维结构中的相对位置。1986年弗兰克和Radermacher等人创造了一种叫做随机圆锥旋转的方法，可以确定二维投影在三维结构中的相对位置。
弗兰克在理论方面对电镜生物学的发展做出了巨大的贡献，他还开发了电镜处理软件SPIDER。
21世纪初发明的直接电子探测技术（DED），相比以前的CCD，DED不需要将电子信号转换为光信号，而是直接检测电子信号，减少了转化时引入的多余噪音。2012年DED被引入冷冻电镜，使用单颗粒冷冻电镜的方法，跨膜蛋白TRPV1的结构被解析到了0.38nm。如今的单颗粒冷冻电子，334kDa的蛋白质结构分辨率可以达到0.18nm，64kDa的蛋白结构分辨率可以达到0.32nm。
电镜的发展进展
总结来说，人们对生物体的认识过程如下：生命体-组织器官-细胞-细胞器-生物分子。通过肉眼可以观察到自然界中的大部分生物体，通过解剖人们了解了身体的组织器官，光学显微镜使得人们能观察到细胞的结构，而电子显微镜使得人们能进一步观察到细胞器的结构，直至冷冻电镜的发展，人们现在已经可以观察到许多生物分子的结构了。
总结一下三人的贡献，杜波谢发明的制样方法使得电镜生物学进入了冷冻电镜时代，为解析高分辨结构奠定了基础。亨德森的工作不仅是第一个将膜蛋白解析到了原子水平分辨率，也给冷冻电镜解析原子水平分辨率结构增强了信心。弗兰克在理论方面对电镜生物学的发展做出了巨大的贡献，他还开发了电镜处理软件SPIDER。
参考资料
[2]李治非,高宁.冷冻电镜技术应用于生物分子高分辨结构解析——2017年诺贝尔化学奖浅谈[J].大学化学,2018,33(01):1-6.